Génotypage des souches iraniennes d’Helicobacter pylori basé sur la PCR-RFLP des gènes conservés et non-conservés

Helicobacter pylori infecte une vaste majorité de la population mondiale. C’est une cause p rouvée de la gastrite antrale et, dans certains cas, il produit des complications plus s é v è res tel que l’ulcère du duodénum (1) et des cancers gastriques (4). Les infections non traitées dues à H . p y l o r i peuvent persister pendant des décennies. L’incidence mondiale des infections par H .p y l o r i a incité les scientifiques à cherc h e r les marqueurs de virulence qui peuvent être associés aux troubles gastro-intestinaux les plus graves. Dans ce cadre, on a trouvé une p rotéine, vacuolating c y t o t o x i n (vacA). Cette p rotéine est produite par près de 50 % des souches de H. pylori isolées (7) et elle induit la vacuolisation des cellules épithéliales i n v i t r o (14) et in vivo (6, 11). En association avec vacA, une protéine de 120 Kd a été t rouvée et appelée cytotoxin associated gene product A (cagA). Des anticorps contre cagA ont été détectés chez la plupart des malades atteints d’ulcères duodénaux. Depuis la découverte de ces protéines, plusieurs études détaillées ont été effectuées pour cloner, séquencer et analyser les gènes vacA (22) et cagA (5). En 1995, ATHERTON et al. (3) ont étudié plus attentivement le gène vacA de différents isolats avec ou sans activité cytotoxique. Ils ont trouvé parmi ces isolats un aspect de mosaïque dans les allèles qui a donné comme résultat trois différentes séquences signal (s1a, s1b, s2) et deux régions centrales différentes (m1 et m2). Ils ont déterminé que toutes les combinaisons étaient possibles sauf s2/m1. Dans une étude parallèle (2), ils ont trouvé que la séquence signal s1a et la région centrale m1 de vacA des différentes souches sont respectivement plus associées à l’infiltration cellulaire et aux lésions épithéliales ; elles possèdent aussi une plus grande activité du type cytotoxine. En outre, la majorité des malades qui hébergent ces souches présentent des ulcères du duodénum. Depuis, les techniques moléculaires sont employées pour détecter H. pylori dans les différentes populations dyspeptiques et pour corréler leur génotype au diagnostic clinique. Les résultats des études sur les différentes populations de malades sont variables. YAMAOKA et al. (26) ont amplifié par PCR la région 3’ du gène cagA et ont trouvé qu’il y avait au moins quatre sous-types chez les malades japonais qui étaient différents de ceux des souches de l’Occident. Ils ont aussi déterminé que différents sous-types de cagA peuvent être associés à des troubles différents liés à H. pylori. D ’ a u t res diff é rences ont été découvertes : ST R O B E L et coll. (21) ont trouvé un nouveau variant du gène v a c A et l’ont appelé m 1 a. VA N DO O R N et coll (23) ont trouvé, de leur côté, un variant de la séquence signal et l’ont appelé s 1 c . Pour compliquer les choses, FI G U R A et coll. (10) ont trouvé qu’il peut y avoir plusieurs souches positives et négatives du c a g A responsables d’ulcère peptique. Ce statut du c a g A pourrait être en cause dans les a t rophies et les métaplasies intestinales(19). Dans une étude parallèle (9), on a déterminé que des patients du Brésil porteurs de marqueurs du cagA montrent une association étroite avec la maladie, mais les patients de Houston n’ont pas montré une telle corrélation. Alors que, dans une autre étude parallèle avec des malades hollandais et portugais, on a observé une étroite corrélation entre le cagA des souches infectantes et le sous-type s1 de vacA avec les ulcères peptiques et les carcinomes gastriques. ITO et coll. ont effectué des analyses de séquence de tout le gène vacA et ils ont trouvé deux lignées différentes de H. pylori qui circulent dans la population japonaise et qui n’existent pas dans les pays de l’Ouest. Par ailleurs, une étude multinationale (20) a montré une distribution géographique des allèles du vacA d’H. pylori pour lesquelles le vacA s1/cagA positif est associé, dans toutes les situations étudiées, avec l’ulcère peptique. Par contre, dans une autre étude internationale effectuée par le groupe Eurogast (25), le gène cagA variait selon les centres mais n’a pas montré de corrélation avec la prédominance de la maladie gastrique. Les résultats extrêmement variables obtenus par ces différentes études indiquent l’hétérogénéité des isolats de H. pylori. Par conséquent, ce qui est trouvé pour les souches européennes n’est pas nécessairement vrai pour d’autres souches de H . p y l o r i t rouvées dans des populations différentes. C’est pour cela que les scientifiques ont conçu plusieurs méthodologies d’analyse de l’ADN pour prendre les empreintes d’ADN génomique des différentes souches trouvées. Un outil très précieux est l’amplification par PCR de certains gènes conservés et nonconservés et la digestion de ces produits par des enzymes de restriction. Cette méthode est appelée restriction fragment length poly morphism associated with polymerase chain reaction (PCR-RFLP). Dépendant de la variabilité et de l’hétérogénéité du génome dans le segment de ce gène particulier par rapport au site de restriction, différents modèles de digestion sont produits. Avec ces outils, plusieurs groupes ont confirmé l’hétérogénéité des différentes souches de H. pylori (12, 13, 17, 18, 20). Ils ont tous conclu qu’il y a un polymorphisme très important entre les différentes souches de H. pylori, spécialement dans différentes localisations géographiques. De plus, nos résultats préliminaires ont montré que ces modèles peuvent renseigner sur les variations géographiques des souches. En outre, nous avons trouvé que la grande majorité des souches locales sont cagA positives mais ne montrent aucune corrélation avec l’état clinique. Cependant, nous avons obtenu, en utilisant différentes amorces, des fréquences variables de la présence du gène cagA. Cette découverte est une preuve de plus du polymorphisme étendu de ce gène au niveau du génome. C’est pourquoi nous proposons d’isoler les souches d’H . p y l o r i infectant diff é re n t s groupes de malades dyspeptiques iraniens qui incluent les malades atteints de cancer gastrique, d’ulcère peptique et de simple gastrite. Les souches d’H . p y l o r i isolées seront évaluées par PCR-RFLP pour les gènes conservés de l’uréase, v a c A et c a g A. Le profil résultant pour chaque gène sera classé et relié à l’état clinique des malades. Les souches qui présentent des empreintes uniques et sont associées à un certain état clinique seront ensuite analysées pour trouver des fragments d’ADN, en utilisant l’hybridation de l’ADN contre des souches de r é f é rence de H . p y l o r i. Cette étude n’a pas été encore effectuée en Iran et est essentielle pour toute nouvelle étude, y compris l’identification de marqueurs de virulence pertinents et établir de nouveaux candidats pour le vaccin. En outre, des études moléculaires plus étendues nous permettront de mieux qualifier le Groupe Helicobacter dans le Département de biotechnologie de l’Institut Pasteur d’Iran et de devenir un centre de référence pour le pays.